从1881年开始,科赫利用有利条件,开始了探究肺结核病因的实验。每当医院进行结核病人尸解时,科赫必定到场,带走一些结核病的结节。回到研究室,弄碎这些结节,涂在玻璃片上,然后放在高倍显微镜下仔细观察。每次和以前看到的一样,涂片上并没有什么异常的微生物。“它会不会和周围物质同样颜色,以至于我们无法发现?”科赫和他的助手决定用染色法试试看。他们动手准备了各种颜色的化学染料,并且制成许多结核节涂片,对不同颜色的染料进行分组实验。科赫耐心细致地逐片观察,果然在显微镜中发现了颗粒状的亮点,这些亮点有的单个分散着,有的相互排列着。随后,他和助手找来柏林市内所有能找到的各种结核结节――包括人类的和动物的。然后,再用染色法制成的涂片进行观察。
大量观察的结果都显示,这些颗粒状的亮点都是同一种结核菌。科赫为发现了结核菌而欣喜异常。他马不停蹄地继续研究,16天后,终于用血清培养基获得了对结核杆菌的纯培养。他把这种纯培养接种到动物身上,动物也感染了结核菌病。